بافتهای مختلف بدن انسان در فرایندهای طبیعی یا طی آسیبهای سلولی، قطعات کوچکی از مواد ژنتیکی خود را به درون جریان خون آزاد میکنند. سالها بود که دانشمندان این قطعات شناور را تنها تکههایی از کدهای فرسوده میدانستند که کاربرد اصلی آنها در خواندن توالی خطی حروف خلاصه میشد. این رویکرد یکبعدی پایه و اساس روشهای بیوپسی مایع را شکل داد که در آن بررسی جهشهای نقطهای در دیانای آزاد سلولی انجام میگیرد. اما پژوهشهای جدید نشان میدهد که پیامهای بیولوژیک موجود در پلاسما بسیار پیچیدهتر از یک رشته ساده خطی هستند. کشف ساختار چهار رشته ای ژنتیک در خون ثابت میکند که هندسه سهبعدی و نحوه پیچش فضایی مولکولها نیز حامل اطلاعات حیاتی است. این تغییر زاویه دید، نگاه آزمایشگاهی به زیستشناسی مولکولی را وارد مرحله تازهای میکند و لایههای پنهانی از رفتار سلولها را در جریان خون آشکار میسازد.
در تصویر سنتی ژنتیک، ساختار مارپیچ دوگانه دیانای الگوی اصلی شناخته میشود. با این حال، کدهای ژنتیکی در شرایط خاص میتوانند اشکال فضایی بسیار متفاوتی به خود بگیرند. یکی از این فرمهای خاص، ساختارهای چهار رشتهای موسوم به جی-کوآدروپلکس هستند. این آرایش فیزیکی زمانی شکل میگیرد که چهار باز گوانین در یک صفحه مربعی کنار یکدیگر قرار گیرند و با پیوندهای هیدروژنی ویژهای به هم متصل شوند. با روی هم قرار گرفتن چند صفحه از این مربعات گوانینی، یک ساختار فشرده و بسیار پایدار ایجاد میشود. تا پیش از این، دانشمندان وجود این پیچخوردگیهای فضایی را تنها در داخل هسته سلولها و بهویژه در نواحی تنظیمی ژنها و تلومرها تایید کرده بودند. ابهام اصلی این بود که آیا چنین ساختار حساس و پیچیدهای میتواند پس از خروج از سلول، در محیط متلاطم و پر از آنزیمهای تجزیهکننده پلاسما دوام بیاورد یا خیر.
دلیل اصلی که باعث شده بود وجود این اشکال فضایی در خون تا کنون مخفی بماند، به روشهای استخراج آزمایشگاهی بازمیگردد. پروتکلهای متداول برای جداسازی دیانای و آرانای از خون معمولا شامل مراحل حرارتی شدید، استفاده از شویندههای قوی و سانتریفیوژهای سریع است. این مراحل سخت فیزیکی و شیمیایی باعث باز شدن پیچخوردگیهای ظریف مولکولی میشوند و هرگونه هندسه سهبعدی را از بین میبرند. در نتیجه، آنچه در پایان استخراج مشاهده میشد تنها رشتههای صاف و خطی بود. پژوهشگران برای غلبه بر این چالش، یک پروتکل جداسازی بسیار ملایم و بدون اعمال دماهای بالا طراحی کردند. این روش اجازه داد ماده ژنتیکی بدون از دست دادن فرم فضایی طبیعی خود از پلاسمای خون انسان جداسازی شود.
چرا کشف ساختار چهار رشته ای ژنتیک در خون اهمیت دارد؟
تیم تحقیقاتی دانشگاه کلن به سرپرستی روبرت هنسل-هرتش برای سنجش و اثبات وجود واقعی این اشکال فضایی، از یک استراتژی دوگانه استفاده کردند. آنها دو ابزار شناساگر کاملا مستقل را به کار گرفتند. ابزار نخست یک پادتن اختصاصی بود که به شکل ویژه ساختارهای چهار رشتهای جی4 را شناسایی میکرد. ابزار دوم یک مولکول کوچک فلورسنت بود که فقط در صورت اتصال به این هندسه فشرده، نور ساطع میکرد. انجام آزمایشهای رقابتی میان این دو شناساگر نشان داد که هر دو ابزار بر سر اتصال به یک هدف یکسان در پلاسما رقابت میکنند. علاوه بر این، استفاده از یک توالی کنترل که توانایی تشکیل پیچخوردگی چهار رشتهای را نداشت، هیچ سیگنالی تولید نکرد. این نتایج اثبات کرد که سیگنالهای دریافتی حاصل اتصال تصادفی نیستند، بلکه ناشی از حضور واقعی این فرمهای پیچخورده در نمونههای خونی هستند.
این یافتههای علمی در قالب یک پیشنویس پژوهش منتشرشده در پایگاه bioRxiv در دسترس جامعه علمی قرار گرفته است. باید توجه داشت که پیشنویسهای علمی مقالاتی هستند که هنوز مراحل داوری همتا و ارزیابی مستقل توسط سایر متخصصان را طی نکردهاند. با این حال، انتشار آنها امکان بررسی سریعتر فرضیهها و روشهای آزمایشگاهی را فراهم میسازد. بنابراین، اگرچه این شواهد زیستشیمیایی بسیار ارزشمند هستند، اما نباید آنها را به عنوان یافتههای قطعی و ارزیابیشده در مجلات رسمی بالینی تلقی کرد. تکرار این آزمایشها در سایر مراکز تحقیقاتی برای تایید نهایی پروتکلها ضروری خواهد بود.
اهمیت دیگر این کشف، به درک ما از قطعات بسیار کوتاه ماده ژنتیکی مربوط میشود. در کیتهای استخراج استاندارد، قطعاتی که طول آنها حدود 50 حرف ژنتیکی است معمولا به دلیل اندازه کوچک کادربندی از دست میروند. این قطعات بسیار کوتاه اغلب دارای غلظت بالایی از باز گوانین هستند و پتانسیل بالایی برای تشکیل ساختارهای چهار رشتهای دارند. شکل فشرده این مولکولها مانند یک سپر محافظ عمل میکند و مانع از تجزیه سریع آنها توسط آنزیمهای موجود در خون میشود. همین پایداری ساختاری به این قطعات اجازه میدهد تا زمان بیشتری در گردش خون باقی بمانند. فهم این مکانیسم میتواند دیدگاه دانشمندان درباره میزان ماندگاری نشانگرهای زیستی در پلاسما را تغییر دهد.
چالش های زیست شیمیایی در تشخیص دی ان ای و آر ان ای شناور
با وجود دستیابی به این شواهد فیزیکی، هنوز ابهامهای زیستشیمیایی مهمی وجود دارد که باید پاسخ داده شوند. شناساگرهای بهکاررفته در این آزمایش بر اساس تشخیص هندسه سهبعدی عمل میکنند و توانایی تفکیک اسکلت قندی دیانای از آرانای را ندارند. هر دو نوع این مولکولها میتوانند با استفاده از بازهای گوانین، ساختارهای جی4 مشابهی ایجاد کنند. پژوهشگران صراحتا اعلام کردهاند که در حال حاضر نمیتوان تعیین کرد چه درصدی از این ساختارهای چهار رشتهای شناور متعلق به دیانای و چه درصدی متعلق به آرانای هستند. برای حل این مسئله، آزمایشهای بعدی باید از آنزیمهای مخرب اختصاصی استفاده کنند تا نوع دقیق مولکول مشخص شود. پیش از این نیز در پژوهشهای مرتبط با تحلیلهای ژنتیکی ساختار دیانای انسان اهمیت جداسازی دقیق فرمهای مختلف مولکولی برای فهم رفتارهای سلولی اثبات شده بود.
پرسش کلیدی دیگر به منشا این کدهای پیچخورده مربوط میشود. مشخص نیست که آیا این ساختارهای چهار رشتهای درون سلولها تشکیل شده و سپس در اثر مرگ سلولی وارد خون شدهاند، یا اینکه رشتههای خطی پس از ورود به جریان خون و تحت شرایط شیمیایی پلاسما به این شکل تغییر فرم دادهاند. علاوه بر این، تعیین اینکه کدام ارگانها یا بافتهای بدن مسئول رهاسازی این مولکولها هستند نیازمند تسلسلیابی پیشرفته و نگاشت دادهها بر روی ژنوم مرجع است. تا زمانی که این نگاشتها به طور کامل انجام نشود، نمیتوان تصویر دقیقی از منشا بافتی این ساختارها ترسیم کرد.
در حوزه بیوپسی مایع، تمرکز اصلی صنعت پزشکی بر روی تشخیص جهشهای ژنتیکی و تغییرات توالی حروف است. اگرچه ساختارهای چهار رشتهای در نواحی تنظیمی ژنها و ژنوم سلولهای سرطانی حضور فراوانی دارند، اما ارائه ادعاهایی مبنی بر کاربرد مستقیم این کشف در تشخیص سرطان کاملا نادرست است. این مطالعه به هیچ عنوان برای مقایسه نمونههای بالینی بیماران سرطانی با افراد سالم طراحی نشده است. تبدیل یک یافته زیستشیمیایی آزمایشگاهی به یک ابزار تشخیصی بالینی نیازمند ارزیابیهای طولانیمدت، سنجش حساسیت و اختصاصیت در جمعیتهای بزرگ و استانداردسازی پروتکلهای نمونهگیری است.
پیامدهای تحلیلی بیوپسی مایع و آینده سنجش های مولکولی
پیادهسازی روشهای سنجش بر پایه شکل فضایی مولکولها با مانعهای فنی متعددی همراه است. یکی از مهمترین چالشها، پایداری نمونههای خونی در فاصله زمانی میان خونگیری و تحلیل آزمایشگاهی است. تغییرات دما، فشار یا میزان اسیدیته پلاسما میتواند به راحتی ساختارهای حساس چهار رشتهای را تخریب کند یا باعث ایجاد پیچخوردگیهای کاذب شود. بنابراین، اگر قرار باشد این ویژگیهای ساختاری در آینده به عنوان نشانگر زیستی مورد استفاده قرار گیرند، باید پروتکلهای نمونهگیری و مواد نگهدارنده جدیدی توسعه یابند که هندسه فشرده مولکولها را ثابت نگه دارند. بررسیهای دقیق درباره تشخیص اختلالات ژنتیکی کمیاب نیز نشان داده است که چقدر استانداردسازی ابزارهای آزمایشگاهی در دستیابی به نتایج معتبر نقش حیاتی ایفا میکند.
علاوه بر چالشهای نمونهگیری، تداخل پروتئینهای موجود در پلاسما نیز یک مانع بزرگ محسوب میشود. پروتئینهای خونی میتوانند به ساختارهای چهار رشتهای متصل شوند و سایتهای شناسایی را مسدود کنند. این امر مستلزم طراحی روشهای جداسازی جدیدی است که بدون آسیب به شکل فضایی مولکول، پروتئینهای مزاحم را حذف کنند. از سوی دیگر، تحلیل دادههای حاصل از هندسه مولکولی نیازمند الگوریتمهای پردازشی پیچیدهتری است. نرمافزارهای تحلیلی باید بتوانند دادههای حاصل از تسلسلیابی را با مدلهای پیشبینی ساختار سهبعدی ترکیب کنند. این حجم از پردازش محاسباتی، نیاز به زیرساختهای سختافزاری و نرمافزاری قویتری در آزمایشگاههای تشخیصی ایجاد میکند.
نگاه سنتی به قطعات ژنتیکی شناور در خون، آنها را پسماندهای زیستی بیخاصیتی میدانست که تنها به صورت تصادفی در پلاسما رها شدهاند. اما کشف فرمهای فضایی پیچیده و مقاوم نشان میدهد که ممکن است این مولکولها نقشی در ارتباطات میانسلولی یا انتقال پیامهای بیولوژیک داشته باشند. اگر پایداری این ساختارها باعث طولانیتر شدن عمر آنها در خون شود، سیستم ایمنی و سایر سلولها ممکن است واکنشهای متفاوتی به آنها نشان دهند. فهم این تعاملات بیولوژیکی میتواند افقهای جدیدی را در زیستشناسی پزشکی بگشاید و نحوه ارزیابی کدهای ژنتیکی خارج سلولی را دگرگون سازد.
تحول در روشهای آنالیز مولکولی نشان میدهد که دانشمندان در حال عبور از خواندن خطی کدهای ژنتیکی و حرکت به سمت تحلیل هندسه فضایی آنها هستند. پاسخ به این پرسش که آیا ساختارهای چهار رشتهای در خون تنها یک پیامد شیمیایی محیط پلاسما هستند یا بخشی از یک مکانیسم تنظیمکننده هدفمند، مسیر آینده این حوزه تحقیقاتی را مشخص خواهد کرد. با پیشرفت ابزارهای جداسازی و سنجش، باید دید آیا تحلیل همزمان توالی و شکل فضایی مولکولها میتواند معیارهای جدیدی برای ارزیابی سلامت و شناخت بیماریها ارائه دهد یا اینکه پیچیدگیهای فنی مانع از کاربردی شدن این رویکرد در مقیاس وسیع خواهد شد.
